Разглядеть строение клетки с помощью обычного светового микроскопа возможно благодаря тому, что разные участки подготовленного препарата по-иному поглощают свет. Например, клеточная мембрана пропускает свет лучше, чем ядро клетки, и поэтому на ее фоне ядро выглядит темнее. Однако, если структуры имеют одинаковый коэффициент поглощения света, под световым микроскопом они будут выглядеть одинаково прозрачными и различить их будет невозможно.
Андрей Белашов, магистрант факультета фотоники и оптоинформатики, совместно с коллегами из Университета ИТМО и Физико-технического института им. Иоффе разработал микроскоп, который решает эту проблему за счет того, что учитывает другое свойство вещества — коэффициент преломления света. Принцип работы устройства основан на классическом методе получения голограмм с использованием объектного и опорного волновых фронтов. Лазерная установка генерирует когерентное излучение, которое при помощи светоделительного клина делится на два пучка. Один из них проходит через подготовленный препарат, а второй пускается в обход. Затем оба пучка снова объединяются в один, и результат регистрируется камерой.
Различить клеточные структуры удается благодаря тому, что на участках с разными коэффициентами преломления свет распространяется с разной скоростью и волновой фронт излучения, которое проходит через препарат, искривляется. Когда же его объединяют с опорным, неискаженным волновым фронтом, между ними возникает явление интерференции: волны накладываются друг на друга, и в зависимости от разности фаз интенсивность излучения на некоторых участках изображения усиливается, а на некоторых, наоборот, гасится. С помощью специальных численных алгоритмов происходит обработка цифровой голограммы, и в результате получается изображение наподобие тепловой карты: участки, отличающиеся показателем преломления, выделены разными цветами.
Для исследования эффективности своего метода Андрей Белашов и его коллеги взяли раковые клетки HeLa, предоставленные Институтом цитологии РАН, и сравнили изображения, полученные на оптическом и на голографическом микроскопах. При одинаковом увеличении изображения голографический микроскоп позволяет различить больше внутриклеточных структур. Более того, так как показатель преломления вещества может меняться из-за различных факторов, цифровой голографический микроскоп можно использовать не только для анализа самого препарата, но и для изучения его реакции на механическое, химическое, тепловое воздействия и так далее.
«Голографии и интерферометрии уже очень много лет, мы не первые, кто создал такую установку, и уж точно не последние, — комментирует Андрей Белашов. — Но мы усовершенствовали этот метод. Дело в том, что при исследовании биологического препарата в некоторых случаях нельзя использовать сильное лазерное излучение, так как оно может влиять на объект и искажать результаты эксперимента. Приходится использовать слабое излучение, а из-за этого изображение получается плохого качества, на нем возникают посторонние шумы. Поэтому мы разработали алгоритм, который позволяет фильтровать шумы, сохраняя при этом пространственное разрешение».
Теперь исследователи собираются использовать метод цифровой голографической микроскопии для изучения такого процесса, как программируемая смерть клетки. Если освещать клетку излучением на определенной длине волны, молекулы кислорода в ней могут перейти в возбужденное состояние — так называемый синглетный кислород. Он играет важную роль в организмах, выполняя защитные и регуляторные функции, но в некоторых случаях его скопление может привести к гибели клетки. Это свойство используют онкологи: они провоцируют рост количества синглетного кислорода в клетках раковой опухоли и используют эту терапию как менее вредную альтернативу химиотерапии. Поэтому механизм воздействия синглетного кислорода на внутриклеточные структуры представляет интерес, однако его детектирование обычными оптическими методами часто вызывает большие трудности. Тем не менее, в местах взаимодействия синглетного кислорода с клеточной средой выделяется тепло, и в результате меняется коэффициент преломления света. Для регистрации этого изменения, а значит, детектирования синглетного кислорода, исследователи предлагают использовать цифровой голографический микроскоп.
В декабре 2015 года цифровой голографический микроскоп для исследования внутриклеточных процессов был признан одним из лучших петербургских проектов программы «УМНИК» в секции «Новые приборы и аппаратные комплексы». Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, который проводит конкурс, предоставит победителям грант в размере 400 тысяч рублей на два года развития инновационного проекта. Андрей Белашов отмечает, что команда планирует потратить эту сумму на подготовку своего устройства к коммерческому распространению.
«Сейчас нам потребуется провести ряд испытаний нашего микроскопа на различных конкретных процессах. Пока что неясно, какие именно результаты мы получим при воздействии давления или нагрева на живые клетки. Возможно, понадобится совершенствовать конструкцию, использовать другие оптические элементы. Кроме того, сейчас неспециалисту будет сложно разобраться с установкой, поэтому на второй год развития проекта мы планируем привести микроскоп в компактный, мобильный вид, удобный для работы биологов и медиков», — комментирует Андрей Белашов.
Отметим, что по итогам работы исследователи опубликовали ряд статей, ознакомиться с которыми можно на официальных порталах SPIE, OSA Publishing и Technical Physics Letters.
